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Nukleinsäurenachweis Fluoreszenz quantitativer Ct-Wert – ein Hassliebe-Parameter

Nukleinsäurenachweis Fluoreszenz quantitativer Ct-Wert – ein Hassliebe-Parameter

Das „New Coronary Virus Pneumonia Diagnosis and Treatment Program (Trial Ninth Edition)“ verwendet den Nukleinsäurenachweis Ct-Wert ≥35 als eine der wichtigen Grundlagen für die Freigabe des Isolationsmanagements oder die Entlassung.Was stellt also der Ct-Wert des Nukleinsäure-Nachweiskits dar?Sind die Ct-Werte verschiedener Kits vergleichbar?Ist die Leistung des Kits umso besser, je niedriger der Ct-Wert ist?
Der Ct-Wert (Threshold Cycle, Ct) ist die Anzahl der PCR-Zyklen, wenn die Intensität des quantitativen Echtzeit-Fluoreszenz-Fluoreszenzsignals den eingestellten Schwellenwert überschreitet.Nukleinsäure-Nachweiskits nehmen sich die neue Krone zum Vorbild.Für die gleiche Reaktion des gleichen Kits zum Nachweis zweier virushaltiger Proben, A und B, repräsentiert die Größe des Ct-Werts gewissermaßen die Kopienzahl des viralen Gens, also die Viruslast.Je niedriger der Ct von Probe B, desto höher die Viruslast.Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur Viruslast und ihrer Infektiosität.Die Vor- und Nachteile verschiedener Echtzeit-Fluoreszenz-Quantifizierungskits können nicht allein anhand der Größe des Ct-Werts beurteilt werden, da die Ct-Werte verschiedener Kits nicht vergleichbar sind.Die Leistungsbewertung des Kits muss anhand der Aspekte Sensitivität (minimale Nachweisgrenze), Spezifität, Präzision, Stabilität und diagnostische Anwendung gemessen werden.Jeder Hersteller von Reagenzien hat seine eigenen achtzehn Arten von Kampfkünsten, und sie haben ihre eigenen magischen Kräfte in der Anwendung, daher werde ich hier nicht ins Detail gehen.
Bei konventionellen quantitativen Echtzeit-PCR (QPCR)-Analysegeräten/-systemen ist die Erfassung von Ct-Werten und ihre weit verbreitete Verwendung in Anwendungen zum Nachweis von Krankheitserregern jedem vertraut.Mit der Entwicklung der Industrie und dem Fortschritt der Technologie sind QPCR-Geräte und -Reagenzien auf Chancen und Herausforderungen gestoßen.Yiou Think Tank (2021 Research Report on China’s Genetic Testing Industry: Technology) analysierte, dass die meisten Unternehmen in der QPCR-Branche meines Landes mit gemeinsamen Problemen auf der Grundlage von Technologie konfrontiert sind.Als Reaktion auf diese Probleme werden die Lösungen hauptsächlich in zwei Arten unterteilt: Beschleunigung der technologischen Verbesserung und Einsatz neuer Technologien.
POCT für die molekulare QPCR-Diagnose ist eine der Entwicklungsrichtungen der Industrie, und die Verbesserung der Leistung ist ein wichtiger Faktor, um die Anwendung der Technologie zu beschleunigen.Wie kann bei POCT-Geräten mit QPCR-Einzelprobendurchsatz der Ct-Wert des Schlüsselparameters einer einzelnen Reaktion in F&E optimiert werden?Bei gleicher Ausrüstung, gleichem Reaktionssystem und gleicher Templatkonzentration ist theoretisch die Effizienz des Enzyms in der Reaktion umso geringer, je größer der Ct-Wert einer einzelnen Reaktion ist.
Im Zuge der Verbesserung der Effizienz der Enzymreaktion und der Optimierung des Ct-Wertes kann zunächst eine typische quantitative Amplifikationskurve der Fluoreszenz aus 40 PCR-Zyklen analysiert werden.Die Amplifikationskurve in der Abbildung unten ist in Fluoreszenzhintergrundphase, exponentielle Amplifikationsphase, lineare Phase und Plateauphase unterteilt.Um einen niedrigeren Fluoreszenzhintergrund zu erreichen, der sich so weit wie möglich vom Fluoreszenzwert der frühen exponentiellen Amplifikation unterscheidet, ist es notwendig, den Träger der Reaktionsverbrauchsmaterialien, das Screening des Primersondendesigns und das Reaktionspuffersystem zu testen.Die exponentielle Amplifikationsdauer ist die direkteste Reaktion der Enzymaktivität und zugleich der Beweis für die perfekte Abstimmung von POCT-Geräten, Reaktionsträgern und Reagenzien.Zu diesem Zeitpunkt müssen die Gerätetemperaturregelung, die optische Signalerfassung und -analyse, die Trägerbiokompatibilität und die Systemleistung der Reagenzien in allen Aspekten angepasst und getestet werden.Schließlich ist die gesamte Amplifikation abgeschlossen, und die Ergebnisse müssen durch einen rigorosen Datenalgorithmus präsentiert werden, um einen angemessenen Ct-Wert zu erhalten.
CT-Linie
Ein kleiner Schritt in der Optimierung des Ct-Wertes sind die unzähligen Schritte des F&E-Personals.In der Angst und Aufregung des Tages und der Nacht, jedes Mal, wenn „die Berge und Flüsse nirgends zu sehen sind, die Weiden dunkel und die Blumen hell sind und es ein anderes Dorf gibt“, was uns den Mut und die Leidenschaft gibt, vorwärts zu gehen wieder.


Postzeit: 29. September 2022